VIH/SIDA: Suivi virologique…

Par Le National en collaboration avec RGL Maginfo

Il est maintenant bien établi que l’ARN-VIH plasmatique est un marqueur prédictif de l’évolution de l’infection, indépendant et complémentaire du taux de CD4 (Mellors J.W., Munoz A., Giorgi J.V. et al. Plasma viral load and CD4 lymphoctes as the pronostic markers of HIV-1 infection. Ann. Intern. Med., 1997, 126 : 6946-954). Ce marqueur se révèle indispensable au suivi thérapeutique, apportant une information pertinente sur l’efficacité, la tolérance, voire l’observance d’un traitement antirétroviral.

Réduire la charge virale globale de l’organisme est l’objectif thérapeutique principal des antirétroviraux dont le rôle est de bloquer la réplication virale et d’empêcher l’extension de l’infection à de nouvelles cellules. Le fait de pouvoir maintenir des niveaux de réplication indétectables avait fait dire à certains qu’il serait possible, en utilisant de tels médicaments, d’éradiquer l’infection et d’éliminer le virus de l’organisme.

Plusieurs résultats récents sont venus contredire cette hypothèse :

– Il est maintenant démontré que, sous traitement efficace au long cours, le stock de cellules infectées à l’état latent diminue progressivement mais faiblement (y compris chez des patients pour lesquels le taux d’ARN-VIH plasmatique est mainteu à un niveau < 20 copies/ml). Cette diminution est de l’ordre de 0,5 log par an et des résultats récents donnent une estimation d’environ 60 ans pour conduire à une éradication virale de l’organisme (Finzi D., Blankson J., Siliciano J. et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV -1, even in patients on effective combinaion thérapy. Nature Medecine, 1999, 5 : 512-517.).

– L’effet des antirétroviraux n’est en fait qu’un simple effet virustastique, ceci est démontré par le fait qu’un arrêt brusque de traitement conduit, dans les jours qui suivent, à une remontée de la réplication virale avec production de particules virales par les cellules circulantes. Ceci a été aussi observé chez des patients dont le taux d’ARN-VIH plasmatique était indétectable depuis plusieurs mois (Jubault V., Burgard M., Le Corfec E., et al. High rebound of plasma and cellular HIV load after discontinuation of triple combination therapy. AIDS, 1998, 12 : 2358-2359).

L’objectif d’éradication virale semble abandonné et les objectifs de recherche thérapeutique actuels visent à montrer qu’il serait possible de stabiliser l’infection dans un état d’équilibre immuno-virologique, sans réplication virale et donc sans évolution clinique.

Il reste de nombreuses questions encore sans réponse à ce jour, concernant notamment l’intérêt au long cours de traitements associant l’immunothérapie, la durée minimale de tels traitements, ainsi que l’intérêt d’éventuelles interruptions de traitement.

En définitive, l’objectif thérapeutique en 1999 aura été à court terme une réduction rapide du taux d’ARN-VIH, associé à long terme à une bonne tolérance et à une bonne acceptation du traitement, pour maintenir au mieux le taux d’ARN-VIH plasmatique le plus bas possible et le plus longtemps possible. Ces conditions sont nécessaires pour maintenir ou restaurer un statut immunitaire fonctionnel, compétent et efficace.

Les trois tests disponibles actuellement en France présentent quelques modifications par rapport aux versions précédentes, cela concerne notamment leur sensibilité :

– le test Monitor 1.5 de la firme Roche a un seuil de sensibilité de 400 copies/ml, il peut être rendu  » ultrasensible  » (selon des modifications d’utilisation) et atteindre un seuil de sensibilité de 20 copies/ml,

– le test Quantiflex (B-DNA) de la firme Chiron-Bayer a une limite de détection de 50 copies/ml,

– le test Nuclisens 2.0 de la firme Organon a une limite de détection de 80 copies/ml (ou de 40 copies/ml si l’on utilise le double de volume de plasma, soit 2 ml).

Des résultats préliminaires obtenus au cours d’essais thérapeutiques suggèrent qu’un taux d’ARN-VIH plasmatique maintenu inférieur à 20 copies/ml soit associé à une suppression virale plus complète et plus durable qu’une réduction d’ARN-VIH à un niveau compris entre 20 et 200 copies/ml, sans que la signification clinique de tels résultats soit claire (Raboud J., Montaner J., Conway B. et al. Suppression of viral load below 20 copies/ml is required to achieve a long-term response to therapy. AIDS, 1998, 12 : 1619-1624).

En définitive, la possibilité de choisir un seuil de détection plus bas (20 copies/ml pour Nuclisens) doit se faire en concertation entre le biologiste et le clinicien.

Des études effectuées lors de l’évaluation pour l’enregistrement de ces nouvelles trousses montrent que leurs caractéristiques sont équivalentes à celles des précédentes en terme de reproductibilité dans la quantification. Par contre, des problèmes de spécificité ont été mis en évidence pour la trousse Quantiflex (environ 7% de faux positifs) et pour la trousse Monitor (moins de 1% de faux positifs).

Ces résultats obtenus à l’aide de sérums VIH-séronégatifs sont importants à prendre en compte lors de l’utilisation de ces tests au cours du diagnostic des primo-infections. Ils imposent la prudence : dans ce contexte, ces tests doivent uniquement être utilisés comme outil complémentaire, le diagnostic définitif de l’infection ne pouvant être posé que sur la présence d’une sérologie VIH positive. Aucune étude à ce jour n’a fait état de résultats d’ARN-VIH faussement positifs chez des sujets VIH séropositifs : dans ce contexte, ce problème de spécificité doit sans doute aussi exister.

La comparaison de résultats d’échantillons quantifiés par les différentes trousses montre que les divergences obtenues pour les formats précédents persistent même si elles se sont atténuées; en cas de changement par le patient de centre ou de laboratoire, ceci doit être pris en compte pour l’analyse des résultats. La recommandation de comparer à l’aide de la même technique les résultats séquentiels d’ARN-VIH plasmatique demeure, particulièrement lors du suivi de valeurs basses proches des valeurs-seuil.

Le résultat chez un même patient peut varier d’un facteur 3 (soit 0,5 log10) sur deux prélèvements consécutifs sans que cela représente une signification particulière; par contre dans les valeurs basses, la variabilité est plus importante et peut dépasser un facteur 3.

Il faut rappeler que des infections intercurrentes ou une vaccination peuvent induire une augmentation transitoire de la charge virale :

• on évitera donc toute mesure au cours de tels événements,
• ou bien on les prendra en compte pour l’interprétation des résultats.

Il faut souligner que les tests de quantification d’ARN-VIH sont spécifiques des souches VIH-1, aucun des tests actuels ne permet la quantification des souches de VIH-2 ni des VIH-1 groupe 0. De fait, en cas de résultats apparemment discordants entre un taux de CD4 bas et un ARN-VIH indétectable, il convient de discuter les résultats avec le biologiste. Lors de l’initiation d’un traitement, il est important de vérifier dans le dossier du patient qu’il existe un résultat positif de Western-blot VIH-1. Les différents tests n’ont pas la même capacité à quantifier les VIH-1 de sous-types non-B qui représentent 15 à 20% des VIH-1 circulant en France.

La trousse Quantiflex présente les meilleurs performances en la matière, cependant la trousse Monitor s’est considérablement améliorée et des difficultés de quantification de certaines souches sont rarement observées. Par contre, la trousse Nuclisens n’a subi aucune modification alors qu’elle présentait de réels défauts de quantification de virus de sous-types non-B, il convient donc d’être très prudent lors de l’analyse de résultats obtenus pour de tels échantillons analysés par cette trousse (particulièrement chez des sujets d’origine africaine). C’est par comparaison des résultats obtenus à l’aide d’une autre trousse que l’on peut identifier un éventuel problème.

La quantification virale dans des compartiments tels que les ganglions ou le liquide séminal n’est pas recommandée actuellement dans la prise en charge de l’infection et le suivi thérapeutique. Les résultats obtenus au cours de protocoles thérapeutiques montrent, dans la majorité des cas, une réelle diminution de l’ARN-VIH du liquide séminal. Cependant, la persistance des cellules infectées a été rapportée par plusieurs groupes. Elle justifie totalement le maintien des mesures de prévention de l’infection, même chez des patients sous traitement efficace.

La quantitifation de l’ARN-VIH plasmatique est, à ce jour, le meilleur marqueur de quantification de la réplication virale. D’autres méthodes permettant notamment la quantification du nombre de cellules infectées latentes (PCR-ADN quantitative) ou celle du nombre de ces cellules en phase réplicative (mesure des ARN-VIH cellulaires) ne sont pas recommandées actuellement, en dehors des protocoles de recherche qui permettront d’en définir l’intérêt, ainsi que l’interprétation des résultats obtenus.

Deux types de tests de résistance existent : les tests génotypiques et phénotypoiques.

La description de ces tests, leur interprétation, et leurs conditions de réalisation sont présentées à la fin du texte. Les recommandations qui suivent ne concernent que les tests génotypiques, les seuls réellement disponibles. Le rôle et la place des tests phénotypiques sont à l’étude.

L’impact de la résistance primaire sur l’efficacité du traitement a été rarement étudié (Id. Ibid). Dans un travail récent mené chez 53 sujets traités au stade de primo-infection, il n’a pas été retrouvé de relation entre les mutations et la réponse virologique ou immunologique à 6, 12 et 18 mois. Des données similaires ont été observées dans la cohote française de primo-infection. Ces résultats suggèrent que d’autres paramètres, comme l’adhésion au traitement, jouent certainement un rôle majeur dans la réponse virologique.

Les recommandations concernent la primo-infection et les infections récentes acquises qui se définissent par une contamination documentée datant de moins d’un an. Une surveillance épidémiologique prospective nationale de la résistance primaire aux antirétroviraux est indispensable. Par ailleurs, il serait souhaitable d’effectuer un recueil rétrospectif des données acquises en 1998 par les laboratoires de virologie qui pratiquent déja ces tests. Afin de permettre la surveillance épidémiologique à l’échelon national et de documenter pour le patient les rares cas où l’on observerait un échec thérapeutique (défini comme la persistance d’un titre d’ARN plasmatique supérieur à 200 copies/ml au 3ème mois de traitement), il est recommandé d’analyser la séquence génétique de la reverse transcriptase et de la protéase, sur le 1er prélèvement disponible du patient, avant toute mise au traitement. En aucun cas, ce test génotypique ne doit retarder la mise au traitement, mais son résultat devra être disponible pour le clinicien dans les trois mois qui suivent. Si le patient est à distance de la séroconversion, l’analyse de la résistance sera effectuée dans le cadre d’études épidémiologiques et indépendamment de l’instauration d’un traitement.

Le rôle des mutations de résistance dans le rebond de la charge virale a été clairement démontré dans les essais thérapeutiques utilisant des antirétroviraux en monothérapie : névirapine, lamvudine, ritonavir. Chez des patients présentant un échappement thérapeutique à un traitement de première intention, comportant un inhibiteur de protéase, plusieurs études ont montré que le rebond de la charge virale ne s’accompagnait pas de détection de mutants résistants vis-à-vis de cette classe d’antirétroviral.

Dans l’essai Trilège l’analyse de l’adhésion au traitement et du rebond de la charge virale montre que les raisons majeures des échappements virologiques dans cet essai d’induction-maintenance sont liées soit à des difficultés à la prise de traitement soit à un pouvoir antiviral insuffisant (dans les bras de bithérapie) –Descamps D., Peytavin G., Calvez V. et al. Virologic failure, resistance and plasma drug measurements in induction maintenance therapy trial (ANRD 072 Trilege). 6th CROI, Chicago 1999, abstract n° 493 – . Des résultats comparables ont été montrés dans l’analyse des échappements lors de traitement de première intention : ACTG 343, dont le plan d’étude est similaire à Trilège, ou ACTG 347 comparant l’amprénavir associé à la zidovudine et à la lamivudine à l’amprénavir en monothérapie ou encore l’essai Mikado associant stavudine,, zalcitabine et saquinavir soft gel.

Ainsi dans ces essais de traitement de première intention, le rebond de la charge virale ne s’accompagne pas de détection de mutations de résistance, sauf celle associée à la résistance à la lamivudine. Mais l’on sait que celle-ci est habituellement sélectionnée en quelques jours dès que l’ARN-VIH plasmatique devient détectable chez un patient recevant de la lamivudine.

Le rôle de la résistance dans ces échecs virologiqes à un traitement de première intention ne semble donc pas déterminant, contrairement à ceux de l’adhésion ou de l’insuffisance de puissance du traitement antiviral. Il ne faut pas écarter la possibilité que les tests de résistance actuels ne soient pas capables de détecter une population virale résistante minoritaire. Il faut aussi insister sur le fait que toutes ces études ont analysé le rebond viral précoce, du fait d’un suivi rapproché des patients, ce qui ne correspond pas obligatoirement à la pratique clinique habituelle.

Dans les échecs à des traitements de 2ème, 3ème ou 4ème intention, le rôle de la résistance est mieux établi. Plusieurs études rétrospectives ont documenté la valeur prédictive des tests de résistance sur l’efficacité d’un traitement alternatif. La réponse au traitement mesurée sur la diminution de la charge virale à la 12ème ou 24ème semaine, est corrélée à l’analyse phénotypique ou génotypique des souches avant l’instauration du nouveau traitement. Chez des patients antérieurement traités par des analogues nucléosidiques, la réponse à l’abacavir dépend de la sensibilité phénotypique des souches virales à cette molécule (Lanier R., Danehower S., Daluge S; et al. Genotypic and phenotypic correlates of response to abacavir. 2nd international workshop on HIV drug resistance and treatment strategies. Lake Maggiore 1998, abstract n° 52). Les mêmes auteurs ont montré que chez des patients traités à la zidovudine, la réponse à l’abacavir est liée au nombre de mutations associées à la résistance à la zidovudine (Id. Ibid). Chez des patients présentant un échec thérapeutique à un traitement comportant un inhibiteur de protéase, plusieurs présentations ont rapporté la valeur prédictive des résultats de résistance sur l’efficacité d’un traitement alternatif comportant un autre composé de cette même classe. Ainsi, il a été rapporté que la réposne à l’association ritonavir/saquinavir est associée au nombre de mutations sur le gène de la protéase, ainsi, mais à un moindre degré, qu’au titre initial de la charge virale et au nombre de traitements antérieurs (Zolopa A.R., Shafer R.W., Warford A. et al. Predictors of antiviral response to saquinavir/ritonavir therapy in a clinical cohort who have failed prior protease inhibitors : a comparison of clinical characteristics, antiretroviral drug history and HIV genotype. 2nd international workshop on HIV drug resistance and treatment strategies. Lake Maggiore 1998, abstract n° 54). Des résultats similaires ont été présentés en ce qui concerne la réponse au nelfinavir.

Il faut souligner que ce type d’études est difficile à analyser car la réponse ne dépend pas seulement de la molécule étudiée mais aussi des autres antirétroviraux introduits lors du changement thérapeutique. Ainsi, il a été rapporté que chez des patients ayant reçu plusieurs traitements antérieurs, la réponse virologique, après un échec à l’indinavir, n’est maintenue que lorsque la souche virale est sensible phénotypiquement à au moins 2 des 4 antirétroviraux du traitement alternatif (Deeks S.G., Parkin N., Petropoulos C.J. et al. Correlation of baseline phenotype drug susceptibility with 16 week virologic response in a pilot combination therapy study in HIV-infected patients who failed indinavir therapy. 2nd International Workshop on HIV drug resistance and treatment strategies. Lake Maggiore 1998, abstract n° 53). Des résultats similaires ont été présentés dans l’essai Megahaart où une corrélation a été retrouvée entre le nombre de composés actifs (au minimum plus de 3 sur 6 à 8) et la réponse virologique. Enfin, dans l’essai CNAB 2007 associant abacavir, amprénavir et éfavirenz chez des patients très longuement prétraités, les résultats des tests génotypiques n’étaient pas prédictifs de la réponse virologique contrairement aux tests phénotypiques (Ait-Khaled M., Rakik A., Thomas D. et al. HIV-1 baseline genotype/phenotype and virological response following salvage therapy with Ziagen, amprenavir and Sustiva. 6th CROI, Chicago 1999, abstract n° 133).

Deux essais, VIRADAPT et GART, ont évalué prospectivement l’intérêt des tests génotypiques dans la prise en charge de l’échec virologique.

• Dans l’essai VIRADAPT, 108 patients en échec thérapeutique ont été randomisés en 2 groupes : 43 patients ont eu un changement thérapeutique selon les pratiques cliniques habituelles et 65 ont reçu un traitement alternatif guidé par l’examen génotypique interprété selon les recommandations de Standford (Durant J., Cevenbergh P., Halfon P; et al. Drug Resistance genotyping in HIV-1 therapy : the Viradapt randomised controlled trial. Lancet, 1999,
  353 : 2195-2199). La diminution de la charge virale était à M3 et M6 significativement plus importante chez les patients ayant bénéficié d’une analyse génotypique (-1,2 et -1,3 log) que chez ceux traités en fonction de l’histoire thérapeutique antérieure (-0,45 et -0,78 log). Le pourcentage de patients dont la charge virale devenait indétectable était significativement plus élevé à M3 (31 vs 15%) mais plus à M6.
• Dans l’essai GART, 78 patients étaient inclus dans un bras où le choix du traitement se faisait sur la base des résultats des tests génotypiques et 75 patients dans un bras où le traitement était choisi selon les bonnes pratiques cliniques (Baxter J.D., Mayers D.L., Wentworth D.N. et al. A pilot study of the short-term effects of antiretroviral management based on plasma genotypic antiretroviral resistance testing – GART – in patients failing antiretroviral therapy. 6th CROI, Chicago 1999, abstract n° LB8). La diminution de la charge virale était significativement différente à M1 et M2 (-1,2 log versus -0,6) mais ne l’était plus à M3. La diminution de la charge virale était corrélée au nombre de drogues actives prescrites. En fait le traitement suggéré par le groupe d’experts dans le bras avec génotype n’a été réellement prescrit que dans 54% des cas. D’autre part, il faut souligner l’absence d’un bras où le groupe d’experts aurait donné son avis en l’absence des résultats des tests génotypiques.

Ces deux essais prospectifs semblent montrer l’intérêt de l’utilisation des tests génotypiques au cours d’un changement de traitement, dans un suivi à court terme. Ils ne montrent pas dans quelle situation clinique (1er échec ou échecs ultérieurs) le génotype est le plus utile. Plusieurs essais de ce type sont en cours aux USA et en Europe, dont l’essai Narval en France où les patients sont randomisés dans 3 bras : phénotype, génotype et pratique clinique.

Echec au traitement initial

Les tests de résistance peuvent ne pas être très informatifs s’ils sont réalisés précocement lors de l’échappement virologique. Il est certain que dans cette situation clinique, les traitements alternatifs possibles sont encore nombreux mais aussi que ce potentiel thérapeutique doit être préservé.

Dans certains cas d’échec à un traitement de 1ère intention, les tests de résistance peuvent être particulièrement utiles pour éliminer les antirétroviraux qui s’avèreraient inefficaces du fait des résistances croisées : par exemple, après un traitement par la zidovudine, un traitement alternatif par l’abacavir ou la stavudine peut s’avérer peu efficace, si de nombreuses mutations associées à la résistance à la zidovudine ont été sélectionnées. De même, il est connu qu’un traitement par l’indinavir ou le nelfinavir peut sélectionner la mutation au codon 90 du gène de la protéase qui obère toute efficacité d’un traitement alternatif par le saquinavir.

C’est aussi le cas lorsque la stratégie thérapeutique a comporté un changement différé par rapport au rebond de la charge virale, avec réplication virale pendant plusieurs mois, même à un niveau relativement modéré (de l’ordre de 5 000 copis/ml par exemple), qui entraîne à terme la sélection de mutations de résistance.

Dans tous les cas la prescription d’un test de résistance doit s’inscrire dans une démarche de changement thérapeutique et de ne doit pas servir à décider de ce changement.

Echec à un traitement de 2ème, 3ème intention

L’échec à un traitement de 2ème ou de 3ème intention constitue une indication des tests analysant la résistance du VIH aux antirétroviraux. Dans cette situation, le niveau de charge virale est compatible avec la sensibilité des tests (les tests génotypiques sont plus difficiles à réaliser lorsque la mesure de l’ARN-VIH plasmatique est inférieure à 1 000 copies/ml) qui peuvent ainsi être utilisés pour guider le clinicien dans le choix du nouveau régime thérapeutique. Les tests génotypiques documentant la séquence de la transcriptase inverse et de la protéase, doivent pouvoir s’intégrer à l’ensemble des paramètres clinico-biologiques du patient et l’analyse de la résistance du VIH aux antirétroviraux ne doit pas être dissociée de celle de l’histoire thérapeutique du patient et de son adhésion aux traitements.

L’essai Narval (ANRD 88) devrait permettre de mesurer l’intérêt des tests génotypiques et/ou phénotypiques, dans ces situations cliniques.

Multi-échecs

Plusieurs essais de renforcement thérapeutique associant 7 à 8 antirétroviraux ont analysé les profils de résistance des patients présentant un échec thérapeutique après de nombreux traitements successifs (Miller V., Gute P., Carlebach A. et al. Baseline resistance and virological response to Mega-HAART salvage therapies. 6th CROI, Chicago 1999, abstract n° 130). Les analyses génotypiques montrent que dans ce cas un très grand nombre de mutations de résistance sont présentes dans les gènes de la RT et de la protéase avec une résistance probable à un très grand nombre de médicaments. Les analyses phénotypiques confirment ces résistances, souvent étendues à toute une classe d’antirétroviraux, et les résultats diffèrent peu de ceux du génotype.

L’utilisation des tests génotypiques de résistance chez ces patients ne semble a priori que peu aider au choix des combinaisons antirétrovirales. Dans cette situation très complexe, les tests de résistance peuvent aider à supprimer du traitement des molécules qui en réalité sont inactives. L’absence de mutations associées à des traitements préalablement prescrits peut dans certains cas aider au choix des combinaisons des thérapeutiques qui seront recyclées.

Indications des tests génotypiques de résistance

Méthodes et interprétations

Les tests phénotypiques

Les tests phénotypiques permettent la détermination de la concentration d’antiviraux inhibant 50% (CI 50) ou 90% (CI 90) de la réplication virale. La plupart des tests sont actuellement réalisés par les recombinants-virus-assay (RVA). Cette seconde génération de test a été mise au point en 1994 et repose sur l’obtention de virus recombinants pour réaliser les tests phénotypiques (Kellam P., Larder B.A. Recombinant virus assay : a phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of HIV-1 isolates. Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38 : 23-301). Le génome viral est extrait du plasma des patients puis les gènes d’intérêt (RT et/ou protéase) sont amplifiés par RT-PCR associés à un plasmide contenant le génome viral complet délété vis-à-vis des gènes d’intérêt (RT et/ou protéase) permet d’obtenir des virus recombinants porteurs du gène muté. C’est sur ces virus que seront realisés les tests phénotypiques. L’analyse du résultat est habituellement réalisée par comparaison avec celle d’une souche contrôle sensible.

La souche du patient est considérée comme sensible si sa CI 50 est au maximum 4 fois celle de la souche contrôle, intermédiaire quand elle est 4 à 10 fois supérieure et résistante quand elle est supérieure de plus de 10 fois. Il n’y a pas de validation clinique de cette interprétation.

Ces tests possèdent plusieurs avantages : possibilité de tester les virus plasmatiques (les plus récemment produits) et relative rapidité d’exécution (Hirsch M.S., Conway B., D’Aquila R.T. et al. Antiretroviral drug resistance testing in adults with HIV infection : implications for clinical management. JAMA, 1998, 279 : 1984-1991). Cependant, ces tests, même miniaturisés et automatisés, nécessitent une infrastructure importante (laboratoire de sécurité, équipements …) avec un nombre élevé de techniciens. Ils sont extrêmement coûteux et les contraintes techniques qu’ils imposent rendent leur utilisation très limitée à un tout petit nombre de laboratoires de recherche en France, où leur rôle dans la stratégie thérapeutique est à l’étude.

Aucun essai n’a jusqu’à présent évalué l’intérêt dans la pratique de ce type de test, ni sa supériorité sur les tests génotypiques. L’essai Narval de l’ANRS devrait permettre de répondre à ces deux questions.

Les tests génotypiques

Les tests génotypiques permettent de rechercher les mutations associées à la résistance aux antirétroviraux. La recherhce des mutations s’effectue à partir de l’ARN viral plasmatique après extraction, transciption inverse et amplification par PCR des séquences nucléotidiques codant la transcriptase inverse et la protéase. L’analyse nécessite hibituellement une concentration plasmatique d’ARN viral supérieure à 1 000 copies/ml.

Deux types de tests sont utilisables.

• La première catégorie permet la détermination de la séquence nucléotique complète de la transcriptase inverse ou de la protéase. L’analyse d’autres régions génomiques (sites de clivage gag p7/p1 et p1/p6) est également possible bien que la pertinance clinique reste à préciser. La méthode de référence est le séquençage avec utilisation de dideoxynucléotides fluorescents et de séquenceurs automatiques. Des trousses commercialisées sont disponibles (HIV-1 Genotyping, Perking Elmer Apllied Biosystems; HIV-1 Trugene Visible Genetics). Une autre méthode en cours d’évaluation, la technique des chips ou des puces, est le séquençage par hybridation sur des microsurfaces où sont fixées des sondes oligonucléotidiques (Kozal M.J., Shan N., Shen S. et al. Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. Nat. Med., 1996, 2 : 753-759) Une bonne concordance entre ces deux méthyodes de séquençgae a été récemment rapportée (Gunthard H.F., Wong J.K., Ignacio C.C. et al. Comparative performance of high density oligonucleotide sequencing and dideoxynucleotide sequencing of HIV-1 pol from clinical samples. AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1998, 14 : 869-876).
• La deuxième catégorie de tests repose sur le principe d’hybridation différentielle et limite l’analyse à certains codons spécifiques. Le test LIPA (line Probe ASsay) commercialisé par la firme Abbott ne détecte actuellement qu’un nombre limité de mutations associées à la résistance aux inhibiteurs nucléosidiques de la transcirptase inverse (Stuyver L., Wyseur A., Rombout A. et al. Line Proby Assay for rapid detection of drug-selected mutations in HIV-1 reverse transcriptase gene. Antimicrob. Agents Chemother., 1997, 41 : 284-291). Les performances des tests reposant sur ce principe d’hybridation différentielle sont limitées par le polymorphisme génétique des régions voisines aux codons analysés. Leur intérêt semble par ailleurs restreint du fait du nombre toujours croissant de mutations associées à la résistance aux antirétroviraux.

L’interprétation des mutations associées à la résistance aux antirétroviraux est complexe et nécessite une expertise particulière. Les tableaux ci-dessous (1,2,3) montrent les mutations associées à la résistance aux analogues nucléosidiques, aux inhibiteurs de RT non nucléosidiques et aux inhibiteurs de protéase. Les mutations majeures sont généralement sélectionnées les premières dans le processus d’accumulation des mutations, sont plus ou moins spécifiques de l’inhibiteur et ont un effet important sur la diminution de sensibilité du virus à l’antirétroviral concerné. Les mutations mineures ont peu ou pas d’effet sur le niveau de résistance déja atteint mais peuvent être sélectionnées parce qu’elles permettent au virus de retrouver pleinement ses capacités réplicatives. Cette distinction entre mutations majeures et mineures est essentiellement pertinente pour les mutations associées à la résistance aux inhibiteurs de protéase.

Les avantages des tests génotypiques par rapport aux tests phénotypiques résident dans leur accessibilité, leur rapidité (résultat rendu en moins de 7 jours), et leur aptitude à prédire dans une certaine mesure le phénotype de résistance. Ce dernier point mérite toutefois d’être évalué plus précisément grâce à l’analyse des données génotypiques et phénotypiques obtenues sur les mêmes échantillons. Par ailleurs, on peut attendre de ces tests une reproductibilité inter-laboratoire satisfaisante. Des contrôles de qualité doivent être organisés pour vérifier ce point et garantir la fiabilité des résultats. Les inconvénients des tests génétypiques et phénotypiques résident dans la difficulté à analyser les populations virales mixtes (estimation des proportions de virus résistants et sauvages) et à détecter les populations minoritaires (< à 20%).

Conditions pratiques de réalisation

La réalisation des tests phénotypiques et génotypiques nécessite une charge virale plasmatique minimale de 1 000 copies d’ARN/ml environ, même si parfois des résultats peuvent être obtenus avec des titres moindres d’ARN plasmatique.

• Ils sont réalisés à partir de prélèvement de sang (7 à 10 ml) recueilli sur anticoagulant type EDTA ou Citrate Dextrose. L’héparine est à proscrire à partir du moment où des PCR vont être réalisées. Le transport se fait au laboratoire, à température ambiante, en 6 à 12 h au maximum. Le délai maximal de transport est moins strict que pour les tests de charge virale.
• Une fois décanté, le plasma sera au mieux gardé à – 80° C. Cependant, des tests de résistance peuvent être réalisés, avec succès, à partir de sérums gardés plusieurs mois à – 20° C. Dans certaines situations cliniques, il peut être intéressant d’essayer de les réaliser sur des sérums quand ce sont les seuls échantillons dont on dispose.

L’équipement requis est extrêmement différent selon la technique utilisée. Toute méthode utilisant une PRC nécessitera comme d’habitude, un cloisonnement des manipulations qui devront s’effectuer selon un produit cohérent. Un technicien plein-temps réalise raisonnablement 20 analyses génétypiques (RT et protéase) par semaine. Le coût d’une technique maison standardisée ANRS a été estimé aux alentours de 400 F pour la réalisation du séquençage des gènes RT et IP.

Mise en place des tests de résistance

La mise en place des tests de résistance doit s’accompagner d’un recueil national d’informations sur les indications de leur prescription ainsi que sur leur impact sur le choix thérapeutique. Une fiche  » type  » de recueil d’information doit être élaborée. Il est nécessaire que l’accès aux tests de résistance soit équitable sur le plan national. Dans tous les cas, la prescription puis l’interprétation des tests de résistance doivent résulter d’une action concertée entre clinicien et virologiste.

• La résistance aux antirétroviraux est une des causes de l’échec thérapeutique.
• Les tests génotypiques de résistance sont aujourd’hui disponibles. Il est recommandé que les tests de résistance aux antirétroviraux soient rapidement accessibles.
• L’utilisation de ces tests est indiquée dans les échecs de 2ème et 3ème intention; elle est à considérer dans les multi-échecs et en échec de premier traitement.

Rapp. 1999 ss. Dir. Pr. J.F. Delfraissy